• CV：池田秀一

剣心の師匠にして、飛天御剣流の十三代目継承者。孤児だった剣心を引き取り、飛天御剣流を教える。剣心が あきれるほど、超自信家な性格で、何をやらせても腕が立つ。普段は陶芸家・新津覚之進として隠居生活を 送る。愛剣は「桔梗仙冬月」という長刀。

• CV：白鳥由里

貧乏武家だった三条家の生まれで「赤べこ」で働く少女。内気な性格だけど、真面目で心優しい。 河原で偶然出会った弥彦に、淡い恋心を抱く。

• CV：島本須美

牛鍋屋「赤べこ」の店員で、出身は京都。いつも笑顔は絶やさないが、金銭勘定はしっかりしている。京都 の「白べこ」に双子の姉・冴がいる。

• CV：北村弘一

京都の料亭・葵屋を営む老人という表の顔と、京都探索方という裏の顔を持つ。通称翁（おきな）。普段は明るいスケベキャラで通っているが、巻町 操の育ての親として、常に操を気遣っている。

• CV：湯浅香織、並木のり子

アニメオリジナルキャラクター。小国診療所を営む玄斎老人の孫娘たちで、剣心のことが大好き。

• CV：塩屋翼

剣心たちが世話になっている診療所の医者。高荷 恵を助手にしている。

• CV：菊池英博

• CV：田中真弓

弥彦のライバル的存在。腕の治療のためにドイツに渡ることになり、弥彦と男の約束を交わす。

• CV：坂口芳貞

明治政府の内閣卿。志士雄真実の企みから人々を守るため、剣心に京都行きを依頼する。馬車で移動中、瀬田宗次郎により暗殺される。

• CV：志賀克也

藤田五郎（斎藤 一）の上司にあたる大警視の肩書を持つ。治安を維持するために剣心と協力する事も多い。

• CV：小粥よう子

剣心と敵対する新撰組一番隊組長。池田屋事件などでその剣を振るうが、肺の病に侵される。

• CV：又村奈緒美

新月村に住む少年。斎藤の密偵であった兄をはじめ、両親を志士雄一派に殺され、その復讐をしようとする。

• CV：石川正明

名刀匠・新井赤空の息子。父の作った最後の刀・逆刃刀真打を剣心に託す。

• CV：松本美和

青空の妻。

• CV：平松晶子

かつての安慈の寺に身を寄せていた少女。孤児たちの姉的存在として、最後まで子供たちを守ろうとしていた。

• CV：津田健次郎

アニメオリジナルキャラクター。体は大きいのに気がやさしく、兄弟子にいじめられる力士。

• CV：冨永みーな

弥彦とそっくりな顔立ちの、ジャガラタ国の王子。命を狙われている。

• CV： 槐柳二

シン王子のそばにいる忠臣。

• CV：竹本英史

行き倒れて左之助に助けられた大きな犬。重要な鍵を持ち逃げしたため、組織に追われている。

• CV：笠原弘子

アニメオリジナル話「島原編」のキャラクター。飛天御剣流の使い手である天草翔伍の妹。不治の病を患っている。左之助と出会い、互いに惹かれあう。

• CV：郷田ほづみ

天草兄妹につき従っている男。その昔、天草翔伍に命を救われた恩義がある。

• CV：緒方賢一

当の抜刀斎とは似ても似つかない、左の腕に十字傷を持つ「人斬り抜刀斎」を公言する男。戦災で孤児になった子供たちを養っている。

• CV：柴本浩行

抜刀斎を狙う剣客。小川兵蔵が偽抜刀斎であることを一目で見破る。

• CV：菊池正美

真の芸術を追い求める画学生。箱根の旅館で出会った薫に一目ぼれをし、その想いを絵に表現しようとする。

• CV：八木光生

幕末に江戸を無血開城させた幕臣。現在は政府の要人となっているが、西郷隆盛に資金援助を行った嫌疑を政府からかけられる。

• CV：岩男潤子

勝海舟の娘。大熊大五郎とともに神谷道場に居候することになる。料理上手。

• CV：麦人

• CV：檜山修之

勝海舟の弟子。しかし破門され、神谷道場でお世話になることに。「さいえんす」の力を信じている。

• CV：仁内建之

医者。塚山由太郎を治療したのが縁で、弟子になった由太郎と共にドイツから日本にやってくる。目的は「霊薬」を捜すため。

• CV：家中宏

左之助の赤報隊時代の同志で、錦絵を書く絵師。本名は月岡克浩。赤べこの妙が、彼の描く絵の大ファン。

• CV：子安武人

風水師である風一族の末裔。水一族の霊水が企む東京の中央政権の破壊を阻止するべく、剣心とともに戦う。

• CV：飛田展男

• CV：岩男潤子

• CV：関智一

• CV：甲斐田ゆき